Stimolazione laser infrarosso pulsata a 808nm del nervo uditivo di animali con deficit uditivo

 

Introduzione
Le protesi neurali contemporanee utilizzano la corrente elettrica che stimola direttamente il tessuto neurale per sostituire o assistere la funzione uditiva del sistema nervoso perso a causa di un incidente o di una malattia.
Tra le protesi neurali, gli impianti cocleari sono considerati i dispositivi di maggior successo, ripristinando l'udito in individui sordi da gravi a profondi. Gli impianti cocleari (IC) sfruttano l'organizzazione tonotopica della coclea. Gli IC codificano le informazioni acustiche derivate da suoni ad alta frequenza in treni di impulsi elettrici che vengono consegnati nella base come segnali a bassa frequenza nell'apice della coclea (Kiang et al., 1972; Kiang et al., 1965; Rose et al., 1967).
Pertanto, mediante la stimolazione discreta di una posizione particolare lungo la lunghezza della coclea, i dispositivi tentano di simulare la codifica del suono naturale nel percorso uditivo.
Gli Impianti contemporanei possono utilizzare fino a 24 contatti degli elettrodi (dipende dalla marca e dalla soluzione che propongono) intracellulari che erogano impulsi elettrici al nervo cocleare.

Sebbene gli utenti possano discriminare gli stimoli su più elettrodi, studi clinici e psicofisici hanno dimostrato che gli utenti impiantati non raggiungono prestazioni funzionali su tutti i canali (Eddington et al., 1978; Eddington, 1983; Townshend and White, 1987; Fishman et al., 1997; Dorman et al., 1998; Friesen et al., 2001). Per gli utenti dell'impianto cocleare, le interazioni del canale a causa della diffusione della corrente nelle zone limitrofe del tessuto, i punteggi di riconoscimento vocale fino a un massimo da 7 a 10 contatti dell'elettrodo. I risultati indicano che gli elettrodi IC spesso si attivano ampiamente in sovrapposizione di popolazioni neurali e in alcuni casi di posizioni cocleari inappropriate (Black et al., 1983; Robillard et al., 1979). Controllare la diffusione dell'attivazione e la stimolazione selettiva su una parte più piccola dei neuroni uditivi potrebbe migliorare le prestazioni degli utenti degli IC.

Negli ultimi anni, l'irradiazione del quasi - infrarosso con lunghezze d'onda che vanno da 1,8 a 2,2 μm è stato ampiamente studiato per stimolare il nervo sciatico, il nervo facciale, i nervi uditivi e la corteccia somatosensoriale.

Tra questi studi, la stimolazione del quasi-infrarosso nel sistema uditivo fornisce un nuovo approccio per stimolare i neuroni nella coclea e potrebbe essere potenzialmente utilizzato nella progettazione di un impianto cocleare. Richter et al. riferiscono che la radiazione infrarossa pulsata può attivare i nervi uditivi con alta precisione spaziale in animali con una sordità acuta e profonda, questo tipo di stimolazione nel quasi-infrarosso deve essere ottimizzata prima della sua applicazione pratica in impianti cocleari.

Sebbene il meccanismo per la stimolazione neurale quasi-infrarossa (NINS) è tutt'altro che chiaro, ora è generalmente accettato che gli effetti fototermici determinano i potenziali di azione neurale. In NINS, l'energia infrarossa viene assorbita dall'acqua del tessuto nervoso e poi convertito in calore e in gradiente termico; quando il gradiente di calore cambia nei tessuti nervosi, i recettori o potenziali dei recettori transitori sensibili al calore termicamente mediato nei canali ionici evocherà l'eccitabilità nervosa dei neuroni.

Quindi, le energie infrarosse assorbite dal tessuto neurale determinano la risposta neurale e l'efficienza di assorbimento di energia a infrarossi è un fattore importante nel NINS di conseguenza.
A differenza della stimolazione diretta del nervo sciatico o nervi facciali, in esperimenti uditivi, l'energia del laser a infrarossi è stato conferito da una fibra ottica, collocata vicino alla membrana a finestra tonda dal giro basale della coclea e orientata verso le cellule del ganglio a spirale nella rotazione basale della coclea del gerbillo.
Poiché la coclea è una camera ossea a spirale, cava, conica e piena di linfa, l'energia infrarossa deve passare attraverso di essa, il tessuto molle e nel canale a spirale del modiolo prima che i fotoni raggiungano il nervo uditivo.

Quindi, è importante trasferire l'energia a infrarossi al nervo uditivo nel modo più efficace possibile.

Attualmente sono state selezionate lunghezze d'onda comprese tra 1,9 e 2,2 μm per la  NINS a causa dell'alto coefficiente di assorbimento dell'acqua, ad esempio utilizzando una lunghezza d'onda di 1,937 μm con acqua, il coefficiente di assorbimento di 115 cm-1 per evocare la risposta del nervo uditivo. Questa proprietà di alto assorbimento d'acqua produce il gradiente di calore richiesto per l'eccitazione neurale nel modo più efficace. Tuttavia, si incontreranno alcune sfide quando la stimolazione in quasi-infrarosso con alto coefficiente di assorbimento dell'acqua è usato per il NINS nella coclea. In questo caso, l'energia a infrarossi deve passare attraverso la coclea, la maggior parte dell'energia sarà assorbita dalla linfa, e solo una piccola parte può arrivare al bersaglio. Ad esempio, solo lo 0,3% dell'energia di uscita può raggiungere i neuroni uditivi quando è usata la lunghezza d'onda di 1.937 μm per stimolare la coclea.

Un modo per portare maggiore energia al nervo uditivo è quello di aumentare la potenza di uscita del laser. Tuttavia, questo aumento può portare all'ablazione termica del tessuto.
Poiché l'energia infrarossa è assorbita principalmente dalla linfa della coclea, un'altra via per trasferire un maggior quantitativo di energia per la stimolazione del nervo acustico è quello di ridurre l'assorbimento dell'energia nella linfa tramite l'utilizzo di lunghezze d'onda del quasi - infrarosso con un coefficiente di assorbimento di acqua molto basso per stimolare i neuroni della coclea.
Izzo et al. hanno verificato che con una lunghezza d'onda di circa 1.85 μm, circa il 38% dell'energia raggiunge il nervo uditivo.
L'irradiazione “short wavelength near-infrared” (SW-NIR) ha un basso assorbimento di acqua e permette a più' energia di penetrare in profondità, in particolar modo le lunghezze d'onda intorno agli 800 nm, che sono state ampiamente utilizzate  nella creazione di immagini della corteccia cerebrale.
Sebbene la SW-NIR è stata utilizzata per la stimolazione diretta del nervo sciatico, la probabilità di stimolazione del nervo uditivo è ancora sconosciuta.
L'obiettivo del presente lavoro è di sperimentare come la SW-NIR può penetrare il fluido linfatico per stimolare i nervi uditivi.
Qui, noi abbiamo scelto un laser SW-NIR con una lunghezza d'onda di 808nm per stimolare i nervi uditivi dei porcellini d'india, il potenziale composto uditivo (CAP) del nervo acustico è stato registrato per valutare se un impulso a infrarossi di 808 nm può attivare i neuroni della coclea.

Materiali e metodi
Cavie d'albino (acquistate  dal Centro Animali Sperimentali dell'Università di Chongqing) di entrambi i sessi (peso 250-350g) sono state utilizzate per l'esperimento. Tutte le procedure sono stati eseguite in conformità ai protocolli di cura e uso di animali da laboratorio approvati dalla Terza Università Medica Militare.

Registrazione CAP (Potenziale d'Azione Composto uditivo del nervo acustico)
Durante gli esperimenti, tre aghi per agopuntura sono stati usati come elettrodi di registrazione CAP. Gli elettrodi degli aghi di agopuntura erano isolati con polidimetilsilossano e solo due estremità degli elettrodi possono condurre elettricità. L'elettrodo di registrazione era inserito nel bordo osseo della finestra rotonda dal canale uditivo esterno e, rispettivamente, l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo di messa a terra sono stati inseriti nell'auricola ipsilaterale e sotto la pelle del naso.
Gli elettrodi erano collegati con un sistema fisico a otto canali per l'acquisizione del segnale (RM-6280C, Chengdu Instrument Factory, Chengdu, Cina) per registrare i segnali CAP. La frequenza di campionamento era impostata su 20 kHz. Il segnale registrato
è stato filtrato tra 100 e 3.000 Hz.

Protocolli di stimolazione
Il software Metronome è stato adottato per la generazione acustica degli stimoli con un personal computer; capace di generare suoni nel range 0-80 dB a impulsi con frequenza di ripetizione di 2 Hz. Il segnale acustico è stato generato da un altoparlante che era
posto a 20 cm dall'animale. Acusticamente è stato misurato il potenziale d'azione composto evocato (aCAP) per valutare l'affidabilità della registrazione sperimentale
del sistema (vedi Fig. 1) prima della stimolazione a infrarossi.


Per la stimolazione a infrarossi, un Diodo L
aser C-Mount ad alta potenza da 808 nm è stato utilizzato come sorgente ottica e una sorgente regolabile di corrente  è stata utilizzata per controllare l'output del diodo laser  in modalità impulso.
L'uscita del diodo laser è stata collegata a una fibra ottica del diametro di 105μm, collegata a sua volta a un micromanipolatore e inserita nell'accesso chirurgico al giro basale della coclea.

L'estremità distale alla fine della fibra è stata posizionata vicino la finestra rotonda della membrana e orientata verso le celle del ganglio spirale nel canale di Rosenthal della coclea della cavia.
Durante l'esperimento, la fibra ottica non aveva contatto diretto con il tessuto.
Il laser è stato impostato per irradiare a impulsi della durata di 300μs, e successivamente, è stata cambiata la potenza di uscita da 0.18 a 3.5W e sono state registrate tutti i potenziali CAP per questi parametri di stimolazione.

Analisi dei dati
Tutti i dati sono stati analizzati offline con MatLab 4.
I CAP sono stati approssimati 50 volte, basati sulla sincronizzazione dei segnali di stimolazione.

Figura 3.

Le ampiezze picco-picco dei CAP (vedi figura) misurate dal primo picco negativo (N1) fino al successivo picco positivo (P1), sono stati utilizzati per misurare l'intensità delle risposte uditive neurali.
Errore medio e standard dei CAP delle ampiezze sono state calcolate per gli animali sotto differenti energie di impulsi a infrarosso.

Risultati
Cinque porcellini d'india di entrambi i sessi sono stati esaminati in questo studio.
Due di questi animali sono stati assordati successivamente al protocollo di stimolazione a infrarossi.
Abbiamo registrato con successo gli oCAP di entrambi gli animali sia sani che sordi.

CAP acusticamente ed otticamente evocati nell'udito normale e assordato degli animali sottoposti al test.
A. risposta neurale uditiva dagli stimoli acustici prima e dopo l'intervento assordante; Non è possibile evocare gli stimoli acustici PAC dopo aver distrutto le cellule ciliate sulla membrana basilare.
B. CAP evocati dal laser a 808 nm con diverse durata degli impulsi, dall'alto verso il basso: 100, 300, 400, 600 e 800 μs. Il momento di inizio della stimolazione ottica (STO) è indicata dalla freccia.

Discussione
La maggior parte dei precedenti studi sulla stimolazione neurale a infrarossi erano focalizzate sulle onde lunghe vicino all'infrarosso.
Questo studio è il primo che esamina gli effetti della SW-NIR con onde corte vicine all'infrarosso in un tessuto del nervo uditivo in vivo.
Stimolando con le energie laser a infrarosso da 808nm in modalità SW-NIR nei porcellini d'india, i CAP indotti sono stati osservati sia negli animali con normale capacità uditiva che in quelli sordi.
Confrontando le ampiezze registrate in pattern di stimolazione differenti, l'ampiezza degli oCAP aumenta con l'energia di tipo SW-NIR.
Quando i nervi uditivi dei porcellini d'india sono stati irradiati da questa pulsazione SW-NIR si è ottenuto un CAP dopo la stimolazione dalla irradiazione infrarossa stabile e ripetuta.
La forma d'onda dei CAP evocati dal laser è stata nel complesso con le componenti sequenziali di negative, positive e negative subwave, simili a quelle degli oCAP evocati nella letteratura della LW-NIR.
Questa osservazione indica che la SW-NIR puo' passare attraverso il tessuto intermedio per attivare i neuroni uditivi nella coclea.
Inoltre, come si vede in fig. 3 le ampiezze dei CAP indotte dalla pulsazione SW-NIR aumenta con l'esposizione alla radiazione, rivelando così che il livello di attività del nervo uditivo nella coclea puo' essere modulato regolando l'energia di uscita della SW-NIR.
Infatti, un trend simile è stato osservato quando un impulso LW-NIR è stato usato per stimolare il nervo uditivo nei gerbilli.
Quando la potenza di uscita del laser infrarosso aumenta, maggiore energia raggiunge e si converte in calore nel tessuto neurale nella coclea durante la stimolazione pulsata.
Quindi, più neuroni dentro o intorno al bersaglio venivano attivati e sono stati ottenuti CAP più forti.
Per giustificare ulteriormente che l'irradiazione di lunghezza d'onda di 808 nm può attivare il nervo uditivo, i CAP sono stati registrati dagli animali assordati.
Le cavie profondamente sorde non avevano risposte neuronali agli stimoli acustici dopo che la membrana di base è stata meccanicamente distrutta.
Tuttavia, quando abbiamo usato gli impulsi laser da 808 nm per stimolare la coclea dei porcellini d'India profondamente sordi, i CAP possono essere registrati ripetutamente, i quali hanno indicato che il nervo uditivo nella coclea può essere efficacemente
attivato da impulsi SW-NIR anche se gli stimoli acustici non possono indurre alcuna attivazione neurale.
Questi
risultati hanno suggerito che, sebbene la SW-NIR abbia un minore coefficiente di assorbimento d'acqua, l'impulso laser SW-NIR può attivare il nervo uditivo nella coclea, che potrebbe fornire uno stimolo alternativo per impianti cocleari.

Come osservato, le ampiezze delle CAP registrate in questo studio erano minori della stimolazione neurale infrarossa con una lunghezza d'onda di 1,937 μm sotto la stessa esposizione alle radiazioni. Questo risultato può essere attribuito al diverso
coefficiente di assorbimento dell'acqua per queste due lunghezze d'onda.
L
a lunghezza d'onda utilizzata nel presente esperimento aveva un assorbimento inferiore
dal tessuto neurale, solo circa 0,13 cm-1 nella materia bianca infantile in vivo.
Quando l'irradiazione a infrarossi da 808 nm raggiunge la coclea, le energie assorbite dal volume unitario di tessuto neurale erano inferiori a quelli per infrarossi di 1.937 μm.
Il gradiente termico e l'aumento di temperatura indotto dalla SW-NIR erano
minori di quelli indotti dalla LW-NIR e meno neuroni attivati. Inoltre, la posizione dell'elettrodo di registrazione può influenzare l'ampiezza. Nei nostri esperimenti sugli animali assordati, l'elettrodo di registrazione era posizionato sul promontorio tympani.
La posizione di registrazione in relazione alla finestra rotonda può ridurre l'ampiezza della CAP (vedere Fig. 5a).
Anche se i nostri esperimenti hanno fornito alcune prove che la SW-NIR può attivare i nervi uditivi, ulteriori esperimenti sono necessari per ottimizzare il sistema.

C'erano diversi efficaci protocolli di assordamento ototossico per eliminare la funzione delle  cellule ciliate; tuttavia, l'intervento chirurgico per la sordità condotto nel nostro esperimento era un metodo distruttivo, che può distruggere i neuroni uditivi e causare l'inesattezza dei risultati sperimentali. Inoltre, il cambiamento di altri parametri, come i tassi di ripetizione, possono anche influenzare i risultati sperimentali.
Ulteriori esperimenti saranno fatti per ottimizzare il modello animale e i parametri di stimolazione per la SW-NIR.

Conclusioni

Il nostro studio ha presentato un nuovo metodo di stimolazione utilizzando la SWNIR
con lunghezza d'onda del laser di 808-nm per attivare il nervo uditivo in cavie sane e
nelle cavie assordate.
L'esperimento preliminare suggeriva che il quasi-infrarosso con coefficienti di assorbimento inferiori effettivamente passano attraverso la linfa nella coclea e stimolano il nervo uditivo, che può fornire un metodo alternativo per gli impianti cocleari.

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